Ученые впервые напрямую поймали короткоживущие молекулярные состояния, через которые фермент собирает ядро пенициллина. Серия рентгеновских снимков показала этапы реакции, о которых химики спорили больше четырех десятилетий, и обнаружила неожиданное поведение серы и железа в самый важный момент.
В центре реакции находится фермент изопенициллин-N-синтаза, или IPNS. Фермент берет линейную молекулу-предшественник ACV, подключает кислород и при помощи атома железа буквально сворачивает молекулу в два соединенных кольца. Так рождается изопенициллин N с характерным ядром пенициллинов. Первым замыкается четырехчленное β-лактамное кольцо, от которого во многом зависит действие пенициллиновых и цефалоспориновых антибиотиков.
Химики давно знали исходную молекулу и конечный продукт, но ключевые промежуточные состояния постоянно ускользали. Обычная рентгеновская кристаллография хорошо показывает расположение атомов в стабильной структуре, тогда как молекулы внутри работающего фермента быстро переходят из одного состояния в другое. Поэтому исследователям приходилось восстанавливать недостающие этапы по косвенным измерениям и компьютерным расчетам.
Авторы новой работы приготовили микрокристаллы фермента без кислорода, а затем запускали реакцию в строго заданный момент. Крошечные капли с кристаллами помещали на движущуюся ленту и вводили в среду с кислородом. Меняя скорость ленты, исследователи давали реакции идти одну, две, три и больше секунд, после чего сверхкороткий импульс рентгеновского лазера фиксировал расположение атомов. Тысячи снимков с разных стадий позволили собрать реакцию почти покадрово.
Один из самых интересных кадров появился перед замыканием β-лактамного кольца. Фермент образовал промежуточную молекулу тиоальдегида, причем атом серы временно отошел от железа в активном центре. Прямой связи Fe-S в этот момент не оказалось. Ранее химики не могли увидеть структуру напрямую, а расчеты не давали однозначной картины происходящего.
Следующую стадию удалось задержать небольшим химическим трюком. Исследователи заменили часть атомов водорода в исходной молекуле на дейтерий, более тяжелый изотоп водорода. Реакция на нужном участке замедлилась, и прибор успел поймать молекулу уже с замкнутым β-лактамным кольцом. Одновременно сера снова приблизилась к железу и восстановила связь Fe-S. Так ученые получили прямое структурное подтверждение промежуточного состояния, которое раньше существовало главным образом в химических моделях.
Снимки прояснили и роль молекул воды внутри фермента. Вода не просто заполняет свободное пространство рядом с реагирующими атомами. Вместе с железом она помогает передавать протоны и направляет реакцию к последовательному замыканию двух колец. Сам переход с участием высокореакционного железа Fe(IV) исследователи напрямую не поймали, поэтому механизм подтверждают не одни рентгеновские кадры, а их сочетание со спектроскопией, изменением отдельных участков фермента и компьютерными расчетами.
Новый результат сам по себе не дает готового антибиотика. Авторы считают, что подробная карта реакции поможет точнее менять ферменты, которые создают β-лактамные структуры, и искать способы получать новые варианты антибиотических молекул. Не менее важен сам метод: покадровая рентгеновская съемка позволяет разбирать реакции, в которых самые интересные молекулы возникают лишь ненадолго и прежде исчезали раньше, чем ученые успевали рассмотреть их структуру.
