Гидрогели помогают выращивать клетки в трехмерной среде, которая намного ближе к живой ткани, чем плоская поверхность лабораторной чашки. Однако добавить в гидрогель нужные белки, пептиды, ДНК или РНК непросто. Многие методы требуют заранее химически модифицировать биомолекулы, использовать специальные реагенты и проводить несколько последовательных реакций. Исследователи разработали платформу, которая упрощает сборку биоматериалов: полимерная сетка образуется под действием синего света и витамина B2, а биологически активные молекулы можно закреплять внутри без предварительной химической обработки.
Основой служат биополимеры с присоединенной галловой кислотой. Галловая кислота относится к природным антиоксидантам и содержится, например, в растениях, фруктах и чайных листьях. К подготовленным биополимерам добавляют рибофлавин, то есть витамин B2, после чего освещают смесь синим светом. Полимерные цепи быстро связываются друг с другом и образуют гидрогель, насыщенный водой.
Во время той же реакции в полимерной сетке можно закрепить белки, пептиды, ДНК и РНК. Перед добавлением к этим молекулам не нужно присоединять специальные химические группы, поэтому исследователь может менять состав материала без отдельной схемы подготовки для каждого биологического компонента. Один принцип сшивания подходит для разных сочетаний биополимеров и активных молекул.
Гидрогели нужны биологам прежде всего для воспроизведения внеклеточного матрикса, окружающего клетки в организме. В живой ткани клетки находятся среди белков, полисахаридов и других молекул, которые образуют опору, передают механические нагрузки и участвуют в межклеточной сигнализации. Обычная клеточная культура на плоской пластиковой поверхности воспроизводит подобные условия лишь частично. Трехмерный гидрогель позволяет окружить клетки материалом со всех сторон и точнее настроить химические и механические свойства среды.
Сложность многих существующих гидрогелей связана с химией сшивания. Для получения устойчивой сетки разработчикам приходится вводить синтетические добавки, использовать специализированные фотоинициаторы или предварительно модифицировать биомолекулы. Некоторые реагенты повреждают клетки, а химическая обработка белка способна изменить его пространственную структуру и нарушить работу. Поэтому недостаточно просто удержать молекулу внутри геля. После сшивания белок должен сохранить способность взаимодействовать с клетками.
Для проверки исследователи встроили в гидрогель сигнальный белок Wnt3A. Белки семейства Wnt участвуют в передаче сигналов между клетками и регулируют рост, деление и развитие тканей. После воздействия синего света и образования полимерной сетки Wnt3A сохранил биологическую активность и продолжал влиять на поведение клеток. Эксперимент показал, что процесс сшивания не обязательно лишает чувствительные белковые молекулы их функций.
Клетки также хорошо переносили условия получения гидрогеля и сохраняли высокую жизнеспособность. Внутри трехмерной сетки клетки могли расти в окружении, которое по геометрии и механическим свойствам ближе к ткани организма, чем стандартная культура на дне чашки. Такая среда особенно важна при моделировании опухолей, поскольку расположение клеток, жесткость окружающего материала и набор сигнальных молекул способны заметно влиять на их поведение.
Исследователи проверили разные составы гидрогелей на трехмерных моделях колоректального рака. Клетки формировали опухолевые трехмерные структуры, причем характер роста менялся в зависимости от состава материала. Значит, свойства искусственной среды можно подбирать под конкретную биологическую задачу, а затем наблюдать, как клетки реагируют на изменившиеся условия.
Клеточные структуры изучали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа при двадцатикратном увеличении. Ядра окрашивали красителем DAPI в синий цвет, а актин цитоскелета помечали фаллоидином в зеленый. Актин образует часть внутреннего каркаса клетки и помогает оценивать ее форму и организацию внутри трехмерной культуры.
Состав гидрогеля можно менять вместе с его физическими свойствами. Исследователь выбирает биополимеры, добавляет нужные белки или нуклеиновые кислоты и настраивает характеристики материала под конкретный тип ткани. Для одной модели может понадобиться мягкая среда, для другой более жесткая. Аналогично можно менять набор сигналов, которые получают растущие клетки.
Механика полученных гидрогелей тоже важна. Живая ткань не ведет себя как идеально упругая резина: под нагрузкой она постепенно меняет форму, частично рассеивает механическую энергию и способна восстанавливать часть структуры после повреждения. Материалы на основе галловой кислоты сочетают гибкость, вязкоупругие свойства и частичное самовосстановление. Благодаря этим характеристикам клетки получают более реалистичное механическое окружение.
Для светового сшивания разработчики используют рибофлавин вместо многих специализированных фотоинициаторов. Витамин B2 естественным образом встречается в биологических системах и может запускать нужные химические реакции под действием синего света. В некоторых экспериментах отдельный фотоинициатор вообще не понадобился: гидрогель удавалось получить в обычной питательной среде, используемой для выращивания клеточных культур.
Уменьшение количества дополнительных реагентов упрощает не только подготовку материала. Чем меньше посторонних веществ попадает в клеточную культуру, тем легче отделить реакцию клеток на свойства гидрогеля от побочных эффектов химических компонентов. Одновременно сокращается число отдельных этапов, на которых чувствительный белок или другая биомолекула может потерять активность.
Платформу можно использовать для трехмерных клеточных культур, моделей заболеваний, подбора лекарств, биофабрикации и регенеративной медицины. Одна из практических задач связана с персонализированными моделями тканей: состав гидрогеля можно подбирать под определенные клетки и добавлять биологические сигналы, необходимые для конкретного эксперимента.
Модульная схема особенно полезна при создании сложных моделей тканей. Вместо разработки отдельной химической реакции для каждого белка, полимера или фрагмента нуклеиновой кислоты исследователь использует общий механизм сшивания и меняет набор компонентов. В одной трехмерной среде можно совместить опорный биоматериал, активные белки и нуклеиновые кислоты, сохранив жизнеспособность клеток и работу встроенных молекул.
Следующая сложная задача - модели, в которых одновременно присутствуют несколько типов клеток, разные участки имеют неодинаковый состав, а концентрация сигнальных веществ меняется внутри материала. Разработанная система дает возможность постепенно усложнять гидрогель, не меняя основной принцип его получения. Именно возможность независимо подбирать механические свойства и биологический состав делает платформу пригодной для более точного воспроизведения тканей и опухолей в лаборатории.