Ученые научились восстанавливать развитие волосяного фолликула почти кадр за кадром. Для работы исследователи получили трехмерные молекулярные карты сотен фолликулов из кожи новорожденных мышей, определили возраст каждого органа и расположили образцы от самых молодых до зрелых. В результате получилась четырехмерная модель, где к трем пространственным координатам добавилось время. Карта показывает, как клетки постепенно собирают фолликул и в какой момент мутация Foxn1 нарушает рост волос. Исследование опубликовано в журнале Cell.
Волосяной фолликул относится к самым маленьким и многочисленным органам млекопитающих. Небольшой размер не делает его устройство простым. Во время развития клетки должны занять определенные места, получить нужную специализацию, изменить форму и согласовать работу с соседними клетками. Многие органы формируются по сходным принципам, поэтому волосяной фолликул удобен для изучения органогенеза, то есть развития органов.
Увидеть органогенез целиком трудно. Развивающийся орган состоит из множества клеток, которые одновременно делятся, перемещаются, меняют форму и активность генов. Обычный анализ ткани фиксирует состояние клеток в конкретный момент, словно отдельный кадр. Непрерывно наблюдать один и тот же орган на молекулярном уровне в живой ткани значительно сложнее.
Кожа новорожденных мышей помогла обойти ограничение. В одном образце одновременно присутствуют сотни волосяных фолликулов на разных стадиях развития. Одни только начинают закладываться в коже, другие уже растут в глубину ткани, третьи приближаются к зрелому состоянию. Исследователи определили стадию каждого фолликула, а затем расположили органы в хронологическом порядке. Множество отдельных образцов превратилось в последовательность развития.
Для анализа ученые разработали метод 3D DNase-Enhanced Expression Profiling, или 3DEEP. Метод позволяет исследовать достаточно крупные фрагменты кожи и сохранять волосяные фолликулы целиком. Такой подход дает трехмерную картину органа вместо набора небольших плоских срезов.
Работе с молекулами РНК мешает геномная ДНК, присутствующая в клетках. 3DEEP удаляет ДНК из образца и облегчает химическое выявление матричной РНК. Затем исследователи отмечают положение миллионов молекул РНК внутри ткани и строят трехмерную карту экспрессии генов.
Матричная РНК показывает, какие гены в данный момент работают в клетке. Набор активных генов помогает определить тип клетки, степень зрелости и текущие биологические процессы. Благодаря пространственной транскриптомике ученые смогли одновременно увидеть расположение клеток и проследить их молекулярное состояние внутри каждого фолликула.
После построения карт исследователи классифицировали клеточные типы и рассчитали молекулярный возраст каждого фолликула. Затем фолликулы выстроили от ранних стадий к поздним. Последовательность работает по принципу покадровой съемки: соседние кадры принадлежат разным органам, но показывают следующие друг за другом стадии одного процесса.
Четвертым измерением в модели служит время. Непрерывной съемки одного растущего фолликула исследователи не проводили. Временную картину восстановили по большому количеству фолликулов разного возраста. Для просмотра данных также создали интерактивный онлайн-интерфейс, где можно изучать изменения формы и молекулярного состава органа на разных стадиях.
Карта позволила разделить развитие фолликула на несколько последовательных этапов. Сначала клетки-предшественники распределяются в ткани и задают пространственную ось будущего органа, направленную перпендикулярно поверхности кожи. От правильной ориентации зависит дальнейший рост фолликула в глубину.
Затем клетки-предшественники начинают специализироваться. Из исходной популяции возникают разные клеточные типы, необходимые зрелому фолликулу. Для нормального развития важен не один лишь набор клеток. Каждая группа должна перейти в нужное состояние в определенный момент и согласовать изменения с окружающими клетками.
На следующем этапе специализированные клетки растут, меняют форму и перестраивают расположение внутри ткани. Небольшое утолщение кожи постепенно превращается в глубокий зрелый фолликул, подготовленный к образованию волоса. Четырехмерная реконструкция связывает изменения формы органа с молекулярными процессами внутри клеток.
Отдельную часть исследования посвятили мышам с мутацией гена Foxn1. Ген Foxn1 играет важную роль в нормальном развитии волосяных фолликулов и росте волос. У животных с нарушенной работой Foxn1 шерсть не развивается нормально, поэтому исследователи сравнили их фолликулы с органами обычных мышей на одинаковых стадиях.
Сравнение показало задержку развития фолликулов при мутации Foxn1. Причина заключалась не в недостаточном делении клеток. Клетки в измененных фолликулах делились даже активнее, чем в нормальных, но хуже созревали и не успевали вовремя приобретать необходимую специализацию.
Рост числа клеток поэтому не компенсировал нарушение развития. Для нормальной работы фолликула клеткам требуется своевременно обмениваться сигналами и последовательно переключать программы активности генов. Мутация Foxn1 нарушала клеточную коммуникацию и временную согласованность процессов.
Нарушения постепенно расстраивали архитектуру развивающегося органа. Фолликул терял структурную устойчивость и разрушался до того, как успевал сформировать волос. Четырехмерная карта позволила проследить цепочку изменений от мутации гена до нарушения созревания клеток и последующего разрушения фолликула.
Разработанный метод рассчитан не только на исследования волос. Принцип реконструкции времени по большому числу трехмерных молекулярных карт можно использовать для изучения других процессов, которые трудно непрерывно наблюдать внутри живой ткани. Исследователи рассматривают среди возможных направлений врожденные нарушения развития органов и возникновение опухолей. В обоих случаях важно определить момент, когда нормальная последовательность клеточных изменений начинает нарушаться.
Следующая задача связана с человеческой тканью. Если 3DEEP удастся применять при изучении человеческих волосяных фолликулов, исследователи смогут подробнее разбирать причины разных форм выпадения волос у конкретных пациентов. Анализ сможет показать, на каком этапе возникает нарушение: клетки недостаточно созревают, несвоевременно меняют специализацию или теряют нормальную передачу сигналов. Такой уровень детализации может помочь разделять внешне похожие нарушения роста волос по их молекулярным причинам и точнее выбирать направление лечения.