Запах свежего хлеба и возрастные изменения человеческих тканей связаны с похожими химическими реакциями. Сахара взаимодействуют с белками и постепенно образуют конечные продукты гликирования, или AGE. В выпечке реакции идут быстро из-за высокой температуры, а в организме растягиваются на десятилетия. AGE накапливаются в тканях, повреждают долгоживущие белки, снижают их эластичность и поддерживают воспаление. Учёные долго считали часть таких изменений практически необратимой, но новый фермент смог удалить один из самых распространённых видов AGE из человеческих тканей.
Особенно уязвимы белки внеклеточного матрикса, который образует каркас вокруг клеток. Многие из них обновляются очень медленно. Коллаген сохраняется в организме годами, поэтому химические повреждения успевают накапливаться задолго до замены самой молекулы. Постепенно меняются свойства кожи, сухожилий, суставов и стенок сосудов. AGE также связывают с нарушениями работы сердца, почек и глаз, а при сахарном диабете такие соединения накапливаются быстрее.
Предыдущие попытки воздействовать на гликирование в основном помогали замедлить образование новых AGE. С уже изменёнными белками ситуация была сложнее. Препараты могли мешать дальнейшему повреждению, но не возвращали модифицированной аминокислоте исходную структуру. Подходящего человеческого фермента для такой химической очистки тоже не существовало.
Авторы новой работы сосредоточились на Nε-карбоксиметиллизине, сокращённо CML. Соединение образуется при химическом изменении лизина, одной из аминокислот в составе белков, и относится к распространённым конечным продуктам гликирования. CML накапливается в стареющих тканях и участвует в процессах, связанных с хроническим воспалением. Задача исследователей заключалась не в разрушении повреждённого белка, а в удалении самой химической модификации с сохранением белковой цепи.
Подходящий инструмент начали искать среди микробных ферментов. Микроорганизмы постоянно разлагают органические остатки и сталкиваются с повреждёнными белками, поэтому среди их ферментов могли существовать молекулы с нужными химическими свойствами. Компьютерный поиск охватил десятки тысяч микробных последовательностей и предсказанных трёхмерных структур. Особое внимание уделяли ферментам с достаточно доступным активным центром: внутрь должен помещаться CML, встроенный в крупную белковую молекулу, а не только свободное соединение.
Наиболее перспективной основой оказалась глициноксидаза из бактерии, живущей при высокой температуре. Природный фермент уже мог воздействовать на CML, но работал слишком медленно. Исследователи начали менять его методом направленной эволюции: создавали множество вариантов белка, проверяли их эффективность, отбирали лучшие и снова вносили изменения. Метод имитирует естественный отбор в лаборатории и позволяет за несколько циклов получить фермент с нужными свойствами. За разработку направленной эволюции ферментов Фрэнсис Арнольд получила половину Нобелевской премии по химии 2018 года.
После пяти раундов отбора и проверки более 500 миллионов вариантов появилась CMLase. Инженерный фермент работал с CML более чем в десять раз эффективнее исходной микробной молекулы. Главное отличие проявилось при обработке полноценных белков: CMLase могла добраться до модифицированного лизина и удалить повреждение, не разрушая белковую цепь.
Сначала CMLase испытали на белках, искусственно насыщенных CML. В эксперименты вошли коллаген, гемоглобин, альбумин и другие белки. После обработки количество CML заметно снижалось. Химический анализ показал, что фермент превращает модифицированный остаток обратно в обычный лизин. Белок при этом сохраняется, поэтому фермент не просто уничтожает повреждённый участок, а фактически исправляет конкретное химическое изменение.
Эффективность зависела от расположения CML внутри белковой молекулы. Участки на поверхности обычно оставались более доступными, однако одной пространственной доступностью разницу объяснить не удалось. На работу фермента влияли соседние аминокислоты и локальная структура белка. Одни участки CMLase очищала почти полностью, другие реагировали значительно хуже. Для будущей терапии такой разброс важен: ферменту придётся работать не с удобными модельными белками, а с огромным набором молекул внутри настоящей ткани.
Проверять накопленные за десятилетия повреждения на мышах неудобно из-за короткой продолжительности их жизни. Поэтому CMLase нанесли непосредственно на донорские человеческие ткани. В белках хрусталика 64-летнего донора количество CML после ночной обработки заметно уменьшилось. Разные методы измерения показали разную степень снижения, поскольку одни учитывали все модификации, а другие лучше обнаруживали CML на доступной поверхности белков.
Самый наглядный результат получили на ткани аорты 75-летнего человека. До обработки в сосудистой стенке находилось значительно больше CML, чем в молодых образцах. CMLase снизила его содержание примерно на 70%, приблизив показатель к уровню ткани гораздо более молодого человека. В образцах кожи пожилых доноров фермент также удалил значительную часть накопившегося CML. Исследование тем самым показало работу не только с искусственно повреждёнными белками в пробирке, но и с соединениями, естественно накопившимися в человеческом организме за десятилетия.
Снижение уровня CML пока нельзя приравнивать к омоложению тканей. Эксперименты подтвердили химическое удаление конкретного возрастного повреждения, но не показали, вернёт ли обработка старому сосуду эластичность, улучшит ли состояние кожи или изменит работу органа. Все опыты с человеческими образцами проводились вне организма. В живом теле ферменту придётся сохранять активность достаточно долго, проникать через плотный внеклеточный матрикс и добираться до нужных белков.
Ещё одна проблема связана с происхождением CMLase. Фермент разработан на основе бактериального белка, поэтому иммунная система может распознать его как чужеродный, особенно после повторных введений. Собственные ферменты организма также способны разрушить CMLase до достижения цели. Разработчикам предстоит повысить стабильность молекулы, проверить иммунную реакцию и подобрать способы доставки в конкретные ткани.
CML охватывает лишь один вид повреждений из большого семейства конечных продуктов гликирования. Поэтому CMLase не обращает старение вспять целиком и не возвращает тканям молодой возраст. Работа доказывает более конкретную вещь: некоторые химические изменения долгоживущих белков, которые десятилетиями считались практически необратимыми, можно удалить ферментом и восстановить исходную аминокислоту. Исследователи теперь проверяют, удастся ли применить тот же принцип к другим видам молекулярных повреждений.
