Чистка ДНК без права на ошибку: генный редактор ME-ABE — единственный шанс не убить пациента лечением

Редактирование генов за несколько лет прошло путь от лабораторной идеи до лечения тяжелых и смертельных болезней. Один из самых заметных инструментов в этой области - базовое редактирование, метод точечной правки ДНК без разрыва обеих цепей. Технологию создала Алексис Комор из Калифорнийского университета в Сан-Диего, и теперь та же группа пытается решить проблему, которая особенно мешает клиническому применению: как сохранить высокую точность правки и при этом не задевать соседние участки генома.

Новая работа посвящена так называемым побочным правкам. Суть проблемы выглядит так. Редактор должен заменить одну конкретную букву в ДНК, но иногда вместе с нужной мишенью меняет и соседние. Для молекулярной биологии такая ошибка не всегда безобидна. Иногда лишняя замена ничего не портит, но в других случаях вмешательство может изменить работу клетки или вовсе привести к ее гибели. А для будущих терапий риск особенно заметен: даже удачная нужная правка теряет смысл, если рядом появляются лишние.

В центре работы - адениновые базовые редакторы, или ABE. Такие системы умеют превращать аденин, одну из четырех основных букв ДНК, в гуанин. На бумаге задача выглядит очень точечной, но на практике рядом с целевой позицией часто находятся другие аденины. Тогда фермент может сработать не по одному адресу, а сразу по нескольким. В результате вместо одной нужной замены исследователи получают целую группу изменений в небольшом отрезке ДНК.

Чтобы уменьшить число лишних правок, ученые обычно пытаются сузить так называемое окно редактирования. Под этим выражением понимают участок последовательности, в пределах которого редактор способен менять буквы. Чем уже окно, тем ниже шанс задеть соседние позиции. Проблема в том, что такой подход часто бьет по главному качеству инструмента - по эффективности нужной правки. Редактор становится аккуратнее, но работает слабее. Команда Комор попыталась выйти из этого тупика и найти вариант, который даст и узкое окно, и хорошую активность.

Для работы исследователи взяли один из ранних вариантов инструмента - ABE7.10. У него уже было важное преимущество: более узкое окно редактирования по сравнению с новыми редакторами ABE8.20 и ABE8e. Но вместе с аккуратностью ABE7.10 нес и недостаток - сравнительно низкую эффективность. Более свежие версии правят целевую позицию лучше и поэтому уже широко применяются, в том числе в клинических исследованиях. Цена за такую активность хорошо известна: лишних изменений вокруг мишени у ABE8-редакторов заметно больше.

Команда хотела получить лучшее из двух миров: точность ABE7.10 и силу более новых версий. Для этого исследователи разобрали старый редактор буквально по деталям. ABE7.10 работает благодаря специально измененному ферменту, в который ранее внесли 14 точечных мутаций. Все эти изменения нашли с помощью направленной эволюции - метода, за который в 2018 году вручили Нобелевскую премию по химии. Суть метода в том, что ученые создают множество вариантов молекулы, отбирают самые удачные и постепенно улучшают нужное свойство. Проблема в другом: после отбора не всегда ясно, какой вклад вносит каждая отдельная мутация.

Чтобы разобраться, Мэллори Эванофф из лаборатории Комор поочередно вернула каждую из 14 мутаций к исходному, дикому варианту. Такой прием называют реверсионным анализом. По сути, исследователь не добавляет новые изменения, а снимает старые по одному и смотрит, что происходит с активностью инструмента. После этого Эванофф проверила все 14 вариантов и в клетках человека, и в клетках бактерии E. coli.

Именно здесь всплыла важная деталь. Часть мутаций вела себя в бактериях и человеческих клетках похоже, но некоторые работали по-разному в двух системах. Наблюдение выглядит принципиальным, потому что многие редакторы создавались и отбирались в бактериальных клетках, а применять их в итоге собираются в клетках человека. Если полезное изменение хорошо показывает себя в одной системе, но не дает выигрыша в другой, инструмент может нести лишний груз без реальной пользы.

После сравнения Эванофф выделила пять мутаций, удаление которых по отдельности либо не ухудшало работу редактора в человеческих клетках, либо даже повышало активность. Затем исследователь объединила все пять обратных замен в одной конструкции. Так появился новый вариант, который авторы назвали minimally evolved ABE, или ME-ABE - минимально эволюционированный адениновый базовый редактор.

Результат оказался как раз тем, к чему команда стремилась. ME-ABE сохранил узкое окно редактирования, характерное для ABE7.10, но по активности приблизился к более современным и более мощным вариантам ABE8. Иначе говоря, исследователям удалось разорвать привычную связку, при которой рост эффективности почти автоматически расширял окно редактирования и увеличивал число побочных правок. Для области, где любую лишнюю замену приходится рассматривать как потенциальный риск, такая развязка выглядит очень важной.

Практический смысл работы выходит далеко за рамки чистой молекулярной инженерии. Между геномами двух людей могут быть миллионы различий. Большая часть таких вариантов безвредна, но некоторые приводят к тяжелым наследственным болезням. Дальше начинается почти детективная работа: нужно понять, какая именно мутация вызывает симптомы, а какая просто присутствует рядом и ни на что не влияет. Без точных инструментов разобрать картину очень трудно.

ME-ABE здесь полезен сразу в двух направлениях. Сначала исследователи могут ввести конкретную мутацию в модельную систему - например, в клеточную линию или лабораторный организм - и проверить, действительно ли именно она вызывает болезнь. Подход помогает не гадать по косвенным признакам, а напрямую смотреть, что меняется после точечной правки. Второй сценарий уже ближе к терапии: если причина болезни известна, редактор можно использовать для обратной замены и попытки исправить дефектную букву в ДНК.

Авторы работы подчеркивают, что новый инструмент полезен и для моделирования болезней, и для создания персонализированных методов лечения. Персонализированных в буквальном смысле: у разных пациентов даже при похожем диагнозе набор мутаций может отличаться, а значит, и инструмент для проверки причин болезни или для коррекции придется подбирать более точно. Чем меньше лишних правок делает редактор, тем выше шансы безопасно работать с такими индивидуальными случаями.

причем на этом работа не заканчивается. Команда Комор уже занимается следующими поколениями базовых редакторов и хочет улучшать их не в бактериальных клетках, а сразу в клетках млекопитающих. Логика здесь довольно простая: если будущий инструмент предназначен для человеческих клеток, отбирать и настраивать его лучше в системе, которая ближе к реальному применению. Новый ME-ABE авторы рассматривают как отправную точку и для собственной работы, и для других лабораторий, которые строят более точные редакторы под конкретные генетические болезни.